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操作流程|如何从类器官建立小鼠单层肠上皮培养体系
使用IntestiCult™类器官生长培养基（OGM）（人）将3D的小鼠肠类器官转化为单层肠上皮培养体系。肠上皮单层培养物可以建立在玻璃盖玻片上，从而实现高质量的成像，也可以建立在Transwell®膜插件上，可以测量物质在上皮层的主动和被动运输以及电屏障功能检测。

肠类器官为研究者提供了一个生理相关的细胞模型，是研究肠道上皮细胞生物学功能和进行肠道疾病建模的宝贵实验工具。然而，肠类器官培养体系的局限性在于，它具有一个封闭的腔室，如需实验需直接作用于顶面（apical surface），实验操作难度较高。

我们在往期的微信推送中推送过人单层肠上皮培养体系的建立，点击这里查看。在本期微信中，我们使用IntestiCult™类器官生长培养基（OGM）（人）将3D的小鼠肠类器官转化为单层肠上皮培养体系。肠上皮单层培养物可以建立在玻璃盖玻片上，从而实现高质量的成像，也可以建立在Transwell®膜插件上，可以测量物质在上皮层的主动和被动运输以及电屏障功能检测。

为什么使用IntestiCult™ OGM（人）衍生小鼠单层肠上皮培养体系？在建立单层之前，在IntestiCult™ OGM（人）中培养小鼠类器官，与使用IntestiCult™类器官生长培养基（OGM）（小鼠）相比，细胞保持更活跃的增殖状态，类器官变大、扩增变快，分化程度更弱。这使得这些细胞能够更有效的形成单层，细胞增殖的速度比单层培养时流失的速度更快；这有助于保持更长的培养时间。实验数据显示，IntestiCult™ OGM（小鼠）是获得细胞类型平衡组合的理想选择，但考虑到小鼠肠道培养物中细胞的快速更新，您需要更多的增殖细胞来进行单层培养。完整的实验材料及详细实验过程清单请点击这里查看，下文为关键步骤的节选部分。

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实验过程
用Corning® Matrigel®进行培养皿包被
单层肠上皮的培养首先要用稀释的Matrigel®溶液对培养皿进行包被。但也可使用成分确定的基质，如胶原蛋白I、胶原蛋白IV和Vitronectin XF™（产品号 #07180）（根据供应商的说明）。
培养基制备
配制IntestiCult™类器官生长培养基（人）
1. 在室温（15 - 25℃）解冻或在2 - 8℃下过夜解冻Basal Medium和Organoid Supplement。完全混匀。解冻后须立即使用，或分装储存于-20℃（最长储存3个月）。解冻后，应立即使用。切忌反复冻融。
2. 混合50 mL的Organoid Supplement和50 mL的Human Basal Medium。完全混匀。注意：如果不立即使用，可在2-8℃保存最多1周。

3. 使用前加入所需的抗生素（如，50 μg/mL 庆大霉素）。

配制IntestiCult™单层生长培养基（人）
在上述1-2步骤的基础上加入10 μM的Y-27632。同样在使用前加入所需的抗生素。

将小鼠肠类器官从IntestiCult™ OGM（小鼠）转化到IntestiCult™ OGM（人）培养基中培养

我们建议将在IntestiCult™ OGM（小鼠）中培养和维持的小鼠肠类器官过渡到IntestiCult™ OGM（人）中，在转化为单层培养前至少在IntestiCult™ OGM（人）中培养一代。

将肠类器官接种为单层培养体系
1. 按照以下描述收集3 - 4个类器官的Matrigel® domes（约含100-150个类器官）。使用不同培养皿时建议收集的dome数量请参考这里的表2。
2. 向每个含有dome的孔中加入1 mL的温和细胞解离试剂（Gentle Cell Dissociation Reagent，GCDR）。
3. 室温（15-25℃）孵育1分钟。
4. 使用1000 μL的移液枪头，用力吹打以吹散Matrigel® dome结构并重悬类器官。
5. 将悬液在室温孵育10分钟，同时轻柔的搅动或震荡。
6. 将所有类器官合并至一管，200 x g ，2 - 8℃，离心5分钟。
7. 弃去上清液。加入3 mL冷的 DMEM/F-12。200 x g，2 - 8℃，离心5分钟。
8. 吸出尽量多的上清液，尽量不要打扰到底部沉淀。将类器官重悬于1 mL预热的（37℃）Trypsin-EDTA（0.05%）中。
9. 用1000 μL的移液枪头将悬液吹打混匀。将类器官在37℃孵育5 - 10分钟。

10. 用力吹打或涡旋以尽量混匀并破坏类器官。将类器官放在显微镜下观察以确认其结构被破坏。类器官应该被分散成单个细胞或小的类器官片段（fragment）。如果有大量大的fragment或整个类器官存在，应重复吹打或涡旋步骤以保证 fragment 被分散（图1）。注意：以下的步骤需尽快完成，因为细胞容易发生聚集。

图1. 以单层接种前，类器官必须被打散成单细胞或小细胞团(A) 单细胞是单层接种最理想选择。(B) 小的细胞团也可以用于单层接种。(C) 大的细胞团不适合进行单层接种。如果吹打混匀后仍存在大的细胞团，建议进行重复吹打和涡旋（第10步）以获得小的细胞团或单个细胞。

11. 加入1 mL DMEM/F-12，吹打混匀。将fragment以200 x g，2 - 8℃，离心5分钟。

12. 吸除上清液，并重新悬浮在IntestiCult™单层生长培养基中的类器官片段（fragment）（培养基制备），如这里的表3所示。

13. 缓慢轻柔地将细胞悬液加入孔中。在37℃和5% CO2培养。每天观察成长情况。每隔2 - 3天进行培养基完全换液。注意：单层一般在2 - 3天内达到100％的汇合率;在附着力差的情况下，增殖率可能会较慢，但如果延长培养时间，依旧可观察到满板。

图2. 在24孔Transwell®培养板中培养的肠上皮单层体系（Intestinal Monolayer）随着培养进行，单层会达到100%汇合率。此过程一般需要2 - 3天，但其会受接种效率影响，而接种效率可能会受到类器官传代次数影响。(A) 低汇合率的人Intestinal Monolayer（小于25%）(B) 接种2天后的人Intestinal Monolayer（50%的汇合率）(C) 培养7天后的人Intestinal Monolayer（100%的汇合率）注意：虽然我们希望小鼠单层看起来类似于上面的代表图像，根据接种效率，起始样品的质量，以及使用的培养器皿，形态上的部分差异是很正常的。


图3. 类器官衍生的单层培养体系代表性的明场（左）和免疫荧光图像（右）的单层衍生（A）人结肠或（B）小鼠结肠。免疫荧光染色的villin（绿色），E-cadherin（红色），和DAPI染色的细胞核（蓝色）。Villin沿细胞顶端边缘染色表示细胞极化，E-cadherin染色表示存在粘着连接。DAPI染色表明上皮细胞基底外侧极附近的细胞核存在。比例尺= 500 μm。

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优化窍门
  • 小鼠单层应使用IntestiCult™类器官生长培养基（人）（OGM）+Y-27632（IntestiCult™单层生长培养基[人]）进行培养，如本实验方案所示。
  • 用于接种成单层的小鼠类器官应使用IntestiCult™ OGM（人）培养，如本实验方案所示。培养基可以在当前代数的第0天，从IntestiCult™ OGM（小鼠）更换至IntestiCult™ OGM（人）。
  • 我们没有数据表明，在IntestiCult™ OGM（人）中进行小鼠肠类器官培养可以改善2D单层的形成。
  • 小鼠单层细胞与人单层细胞相比往往更加脆弱（由于细胞周转率较高），可能难以生长超过几天。
  • 与培养板相比，细胞将更好地粘附在Transwell®插件上，并且更有可能更快地形成汇合单层。细胞在Transwell®小室中的极化和成熟度也比在培养板中更好。
  • 用于单层培养的小鼠类器官不应来自P0或直接来自于肠道/原代组织。我们建议至少使用P1+培养物。
  • 我们建议在整个培养过程中加入Y-27632（ROCKi）。如果需要的话，可以把它去掉，但当Y-27632存在时，它有助于维持单层的活力。如果出于实验目的需要去除，应该等到单层完全汇合后，大约在第7天左右。
  • 理想情况下，你应该等到单层几乎汇合后再做任何下游实验。
  • 小鼠小肠器官细胞的肠单层培养比较困难，由于细胞的高周转率，整个培养体系可能只能保持几天。建议使用结肠衍生的肠道器官，因为我们发现这些往往比小肠样本效果更好。
  • 只要有可能，我们建议开始用更多的接种样本/更高的播种密度的单层培养方案。
  • 接种效率根据类器官传代次数而变化。
  • 最佳的接种密度可以根据培养代数和来源类器官的某些参数而显著变化，所以接种密度有很大的灵活性；应根据起始样品和生长条件进行优化。
  • 使用5%的Matrigel®代替2%的Matrigel®溶液可能有助于提高某些样品的附着效率。包被的培养板在37℃下孵育2 - 4小时，然后再加入细胞，也可能有助于改善细胞附着。
  • 如果需要进行特定实验，可以用DMEM/F-12替换MonolayerGrowth Medium。单层可在DMEM/F-12中维持细胞活力和完整性至少24小时。需要注意的是，小鼠单层培养体系可能仅能维持几天。
  • 完全汇合的肠道单层可以用于下游检测，如TEER，FITC-葡聚糖渗透性，Ussing室分析和免疫细胞化学（ICC）染色。任何用于细胞培养的既定检测方法都可以应用于肠道单层。

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肠类器官培养的相关产品

本操作流程与IntestiCult™ OGM（人）一起使用的效果最好--适用于人和小鼠类器官。然而，有兴趣建立人肠道单层的研究人员建议使用IntestiCult™类器官分化培养基（人），与IntestiCult™ OGM（人）相比，它的分化培养表现更好。

*虽然我们还没有广泛测试这个实验方案与低温保存的小鼠小肠类器官（产品号 ＃70931），无法获取原代小鼠样本的研究者可使用这些冻存的类器官进行实验，但在实验流程上可能需要进一步优化。


                                                                                                                                                                                               2021年5月13日
                                                                                                                                                                                           转载自 STEMCELL公众号
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